Страна партнера
Россия
Разработка новых лекарственных средств для терапии неврологических заболеваний
Разработка новых лекарственных средств для терапии неврологических заболеваний
Год 2022-2024
Департамент Научно-исследовательский институт молекулярной и клеточной медицины медицинского института
В результате выполнения проекта будут получены прототипы биомедицинского клеточного продукта, представляющего собой культуру нейральных стволовых клеток, и ноотропного лекарственного препарата на основе внеклеточных везикул, выделенных из кондиционированной среды.
Полученные культуры нейральных стволовых клеток будут полностью охарактеризованы и соответствовать требованиям, предъявляемым к биомедицинским клеточным продуктам. Будет изучен микроРНКовый и белковый состав внеклеточных везикул, подобраны условия их получения и хранения.
Ожидается, что оба прототипа препаратов будут оказывать терапевтическое действие, которое направлена на уменьшение степени неврологического дефицита и глиоза, препятствие генерализации воспалительного и апоптотического ответа и улучшение пластичности головного мозга.
Будет более подробно изучен заместительный механизм действия клеточного трансплантата и принцип действия внеклеточных везикул. Внедрение разработанных препаратов нового поколения в медицинскую практику приведет к более благоприятным исходам лечения пациентов и будет сопряжена с существенной экономией бюджетных средств за счет снижения потребности в лечебных и реабилитационных мероприятиях, а также будет способствовать восстановлению трудоспособности у пациентов с неврологическими заболеваниями.
Задачи проекта
- Разработать и получить прототип биомедицинского клеточного продукта, представляющего собой культуры нейральных стволовых клеток, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (получить культуры как минимум от трех здоровых доноров). Культуры нейральных стволовых клеток должны быть морфологически и иммунофенотипически охарактеризованы и должны соответствовать требованиям, предъявляемым к биомедицинским клеточным продуктам.
- Разработать протоколы получения прототипа лекарственного средства на основе внеклеточных везикул, выделенных из кондиционированных сред нейральных стволовых клеток. Должны быть подобраны оптимальные условия хранения и метод получения внеклеточных везикул из кондиционированных сред нейральных стволовых клеток. Полученные внеклеточные везикулы должны быть охарактеризованы по наличию тетраспанинов CD9, CD63, CD81 и должны соответствовать размерам 40-120 нм. Должен быть изучен микроРНКовый и белковый состав внеклеточных везикул.
- Оценить нейропротективное действие внеклеточных везикул нейральных стволовых клеток в модели глутаматной эксайтоксичности in vitro. Проанализировать выживаемость (МТТ тест), количество апоптотических и некротических клеток (морфометрический анализ кариопикноза). Оценить уровень транскрипции генов BAX и BCL2, Caspase 3, Caspase 6 методом ОТ – ПЦР и уровень окислительного стресса (DCF анализ).
- Исследовать и сравнить терапевтические эффекты введения НСК и внеклеточных везикул, полученных из кондиционированных сред, на моделях острой фокальной ишемии головного мозга у крыс и черепно-мозговой травмы. Должны быть оценены выживаемость, объем очага повреждения с помощью МРТ исследования, неврологический статус животных с использованием стандартной шкалы для оценки тяжести инсульта mNSS (Modified Neurological Severity Scores) для грызунов, тестов «постановки конечностей на опору» и «цилиндра». Должно быть выполнено гистологическое и иммуногистохимическое исследование головного мозга крыс. Произведена количественная оценка глиальных клеток в области повреждения, сосудов, фагоцитирующих и активированных макрофагов/микроглии по М1 или М2 фенотипу.
- Изучить молекулярные и клеточные механизмы терапевтического действия внеклеточных везикул и трансплантируемых нейральных стволовых клеток. Должно быть проведено молекулярно-генетическое и протеомное исследования тканей головного мозга крыс. Выявлены сигнальные молекулы и пути, связанные с апоптозом, ангиогенезом, воспалением и нейритогенезом. Должен быть изучен заместительный механизм действия клеточного трансплантата на основе данных о выживаемости нейральных стволовых клеток, миграции и способности к дифференцировке в нейроны и астроглию после проведения трансплантации.
Перечень РИД по проекту (ключевых публикаций, патентов, свидетельств)
- Салихова Д.И. Роль микроРНК, секретируемых глиальными клетками в составе внеклеточных везикул, при терапии черепно-мозговой травмы // Всероссийской мультимедийной конференции "Генная терапия: настоящее и будущее" / г. Москва, декабрь 2022 г.
- Шеденкова М.О., Салихова Д.И., Судьина А.К., Белоусова Е.В., Гольдштейн Д.В. Перспективы применения внеклеточных везикул глиальных клеток при терапии черепно-мозговых травм // «Российская наука в современном мире»: L Международная научно-практическая конференция / г. Москва, 2022. – С.64-69.
Цели проекта
- Цель исследования - разработка лекарственных средств на основе нейральных стволовых клеток и внеклеточных везикул, а также исследование механизмов их терапевтического действия на экспериментальных моделях неврологических заболеваний in vitro и in vivo.
Руководитель проекта
Все участники
Салихова Диана Ирековна
кандидат биологических наук
Результаты проекта
Получены культуры индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека с рименением неинтеграцинного метода репрограммирования на основе вируса Сендай из культур фибробластов от 3 здоровых доноров.
Подтверждена плюрипотентность ИПСК человека на молекулярном и функциональном уровнях. Показано, что все культуры ИПСК экспрессируют макеры плюрипотентности как на уровне транскрипции (методом ОТ-ПЦР проанализирована экспрессия генов Oct4, Sox2, Nanog), так и на уровне трансляции (иммуноцитохимическое исследование антителами к белкам Oct4, Nanog, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81).
Подобраны условия дифференцировки ИПСК в нейральном направлении, которые позволяют получить культуры, содержащие более 80% PAX6+- клеток (маркер нейральных стволовых клеток), и использовать для дифференцировки только лишь малые молекулы (SB431542, дорсоморфина и LDN193189), что в дальнейшем позволит удешевить получение биомедицинского клеточного продукта и лекарственного препарата на основе секретируемых внеклеточных везикул.
По подобранным условиям криоконсервации созданы банки ИПСК и их дифференциальных производных - нейральных стволовых клеток, глиальных и нейрональных прогениторных клеток.
Разработан протокол получения внеклеточных везикул, который позволил получить 1,58-3,28*1011 частиц/мл c пиком в области 80-100 нм, что указывает на присутствие преимущественно фракции экзосом.
Подобраны условия хранения кондиционированных сред для последующего выделения внеклеточных везикул. Выявлено, что температура +4 ᵒС, в отличие от температур -20 ᵒС и -80 ᵒС, подходит для недлительнного хранения везикул в растворе. Хотя необходимо дальнейшее функциональное тестирование везикул.
Партнеры